يصبغ علماء
الأحياء الدقيقة Microbiologists عادة الخلايا
البكتيرية قبل النظر اليها لأن السيتوبلازم cytoplasm يفتقر الى اللون،
مما يجعل من الصعب أن ترى الخلايا على خلفية ساطعة
لحقل المجهر microscope. تم تطوير العديد من تقنيات الصبغ لتوفير
التباين للفحص بمجهر الحقل الساطع bright-field microscopy.
لإجراء تقنية صبغ بسيطة، تمسح الخلايا البكتيرية في قطرة من
الماء أو المرق broth على شريحة زجاجية glass slide وتجفف الشريحة بالهواء.
بعد ذلك، تمرر الشريحة لفترة وجيزة عبر اللهب flame في عملية تسمى تثبيت
الحرارة heat
fixation، التي تربط
الخلايا على الشريحة، تقتل أي كائنات حية لا تزال على قيد الحياة، وتزيد من امتصاص
الصبغة. الآن تغمر الشريحة بصبغة قاعدية basic dye (كاتيونية
cationic) مثل أزرق الميثيلين methylene blue. لأن الأصباغ الكاتيونية لها شحنة موجبة positive charge، تنجذب الصبغة إلى السيتوبلازم والجدار الخلوي
cell wall، والتي لها أساساً شحنات سالبة negative charges. من خلال تباين الخلايا الزرقاء على الخلفية
الساطعة، يسمح إجراء الصبغ للفاحص بقياس حجم الخلية وتحديد شكل الخلية. كما أنها
يمكن أن توفر المعلومات حول كيفية ترتيب الخلايا مع بعضها البعض.
تعمل تقنية الصبغ السالبة negative
stain technique بطريقة عكسية. تمزج الخلايا البكتيرية على شريحة مع صبغة حامضية
acidic dye (أنيونية anionic)
مثل النيغروسين nigrosin (صبغة سوداء
black stain) أو الحبر الهندي India
ink (حبر الرسم الأسود black drawing ink). يدفع المزيج بعد ذلك عبر وجه الشريحة ويسمح
للتجفيف بالهواء. لأن الصبغة الأنيونية تحمل
شحنة سالبة، فإنها تبعد من الجدار الخلوي والسيتوبلازم.
لا تدخل الصبغة الخلايا، ويرى الفاحص خلايا واضحة أو
بيضاء على خلفية سوداء أو رمادية. لأن هذه التقنية تتجنب التفاعلات
الكيميائية chemical reactions وتثبيت الحرارة،
تبدو الخلايا أقل ذبولاَ وأقل تشوهاً مما هي عليه في الصبغة البسيطة. تكون أقرب إلى حالتها الطبيعية.
تقنية صبغة غرام هي مثال على إجراء
صبغ تفاضلية، أي أنها تسمح للفاحص بتمييز (فصل) الخلايا
البكتيرية بصريا إلى مجموعتين
استنادا على اختلافات الصبغ. تقنية صبغة غرام سميت نسبة لكريستيان غرام Christian Gram،
الطبيب الدنماركي الذي كان أول من اتقن التقنية في
عام 1884.
الخطوتان
الأولى من هذه التقنية هي مباشرة
straightforward:
1- تصبغ المسحات
مثبتة الحرارة, المجففة بالهواء بالبنفسج البلوري crystal violet،
وتشطف.
2-
يضاف محلول يود غرام الخاص Gram’s iodine solution.
ستظهر جميع الخلايا البكتيرية لون
أزرق - بنفسجي blue-purple إذا تم
إيقاف الإجراء وفحصت العينة بالمجهر الضوئي light
microscope.
3- تشطف المسحة بمزيل لون decolorizer، مثل الكحول 95٪ أو خليط من الكحول والأسيتون alcohol-acetone.
يلاحظ عند هذه المرحلة، قد تفقد بعض الخلايا البكتيرية لونها وتصبح شفافة transparent. هذه هي الخلايا البكتيرية السالبة لغرام gram-
negative. تحتفظ
الأخرى بالبنفسج البلوري
وتمثل الخلايا البكتيرية الموجبة لغرام gram-positive.
4- يستخدم السفرانين safranin، صبغة كاتيونية حمراء، للصبغ المضاد للكائنات السالبة لغرام، والذي يمنحها اللون البرتقالي - الأحمر orange-red. لذلك، في استنتاج التقنية، الخلايا الموجبة لغرام هي زرقاء - بنفسجية بينما الخلايا السالبة لغرام هي برتقالية - حمراء. بشكل مماثل للصبغ البسيط، تسمح صبغة غرام أيضاً للفاحص بتحديد حجم, شكل، وترتيب الخلايا.
معرفة ما إذا كانت
الخلية البكتيرية موجبة لغرام أو سالبة لغرام مهم
لعلماء الأحياء الدقيقة والفنيين السريريين clinical technicians الذين يستخدمون النتائج من تقنية صبغة
غرام لتصنيفها في
دليل بيرجي أو للمساعدة في تعريف الأنواع البكتيرية الغير
معروفة.
تختلف الخلايا
البكتيرية الموجبة لغرام والسالبة
لغرام أيضا في حساسيتها
للمواد الكيميائية مثل المضادات
الحيوية antibiotics (الخلايا الموجبة لغرام أكثر حساسية للبنسلين
penicillin، والخلايا السالبة لغرام أكثر حساسية للتتراسايكلين tetracycline).
أيضا، الخلايا السالبة لغرام لها جدران خلوية أكثر
تعقيدا، ويمكن أن تنتج الأنواع
البكتيرية الموجبة لغرام والسالبة لغرام أنواع مختلفة من السموم toxins.
إجراء صبغ تفاضلي آخر، تقنية الصبغ
المقاوم للحمض acid-fast،
تستحق الذكر. تستخدم هذه التقنيه لتعريف أعضاء جنس المايكوباكتيريوم Mycobacterium، نوع واحد منها يسبب مرض السل tuberculosis. يصعب صبغ هذه الكائنات البكتيرية عادة بصبغة غرام لأن الخلايا لديها جدران شمعية waxy للغاية تقاوم الأصباغ. ومع ذلك، ستتلون الخلايا باللون الأحمر عندما تعامل بالكاربول فوكسين carbol-fuchsin (صبغة حمراء) والحرارة (أو مثبت دهني). تحتفظ الخلايا بعد ذلك بلونها عند غسلها بمحلول الحمض - الكحول acid-alcohol
solution المخفف. تفقد أجناس مصبوغة أخرى اللون الأحمر بسهولة أثناء الغسل بالحمض - الكحول. أنواع المايكوباكتيريوم Mycobacterium، بالتالي، تسمى مقاومة للحمض acid
resistant أو "صامدة للحمض acid fast." لأنها تصبغ باللون الأحمر وتتكسر بحدة عندما تتكاثر، يشار إلى أنواع المايكوباكتيريوم Mycobacterium غالباً باسم "النهاشات الحمر red
snappers".
الشكر موصول
ردحذف